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Título : Implicación de Dot1 en la regulación de los orígenes de replicación en la levadura Saccharomyces cerevisiae, mediante Q-PCR
Autor : Poveda Gabaldón, Ana María
Vásconez Martínez, Jeanneth Karina
Palabras clave : SACCHAROMYCES CEREVISIAE
MUTACIÓN
DNA
ESTABILIDAD GENÓMICA
Fecha de publicación : 2017
Editorial : Quito: UCE
Citación : Vásconez Martínez, Jeanneth Karina (2017). Implicación de Dot1 en la regulación de los orígenes de replicación en la levadura Saccharomyces cerevisiae, mediante Q-PCR. Trabajo de investigación previo a la obtención del Título de Bioquímica Clínica. Carrera de Bioquímica Clínica. Quito: UCE. 54 p.
Resumen : El presente estudio tuvo como propósito determinar la implicación de Dot1 en la regulación de orígenes de replicación durante la síntesis de DNA en Saccharomyces cerevisiae. En fase S del ciclo celular existen mecanismos de control llamados “checkpoints” que detectan daños y permiten su reparación, preservando la estabilidad genómica. Rad9 es una proteína mediadora del checkpoint de daños en el DNA (DDC; del inglés DNA damage checkpoint). No se conoce exactamente el mecanismo de activación, pero las modificaciones ᵧH2A-S129 y H3-K79me pueden ser reconocidas por Rad9, y participar en la activación de esta ruta. Resultados previos obtenidos en el laboratorio donde se desarrolló este trabajo, apuntan a que ᵧH2A-S129 está implicada en el DDC, aquí deseamos determinar si H3-K79me también controla la activación del DDC. Puesto que la metilación de la lisina 79 de la histona H3 es catalizada por la proteína Dot1, la ausencia de meH-K79 se asegura en células mutantes Δdot1. El estado activo/inactivo de los orígenes de replicación tardíos es regulado por el checkpoint de daños en la replicación (DRC; del inglés DNA replication checkpoint), pero en ausencia de Tof1 permite la intervención de Rad9. Cuando no hay problema en el avance de la replicación, los orígenes se activan secuencialmente de acuerdo a su programación (precoces – early/ tardíos - late). Sin embargo, si una vez iniciada la replicación se presentan problemas, se activa el checkpoint, se bloquea la progresión de las horquillas de replicación procedentes de orígenes activos, y se reprime la activación de los orígenes de replicación tardíos que todavía no han sido activados. Para confirmar la función reguladora de Dot1 se determinó el estado de activación de orígenes tardíos, en un mutante Δdot1 Δtof1. El estado de activación/inactivación de los orígenes de replicación se determinó mediante la técnica 2 copy number, que es una Q-PCR (Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa), dirigida a detectar los orígenes de replicación. La técnica 2 copy number puede discernir entre 2 unidades relativas de fluorescencia (origen activo) y 1 unidad relativa de fluorescencia (origen inactivo). La técnica se aplicó para estudiar 5 OR: 1 temprano, 4 tardíos y también una zona de control negativa. Los resultados muestran que células Δdot1Δtof1 son incapaces de reprimir orígenes de replicación tardíos, confirmando la función regulatoria de Dot1 en el DDC presumiblemente activando Rad9
The present study had as purpose to determine the implication of Dot 1 in the regulation of origins of replication during DNA synthesis in Saccharomyces cerevisiae. In S phase of the cell cycle there are control mechanisms called "checkpoints" that detect damages and allow their repair, preserving the genomic stability. Rad 9 is a damage checkpoint mediator protein in DNA (DDC, of English DNA damage checkpoint). It is not exactly known the mechanism of activation, but the modifications yH2A-S129 and H3-K79me can be recognized by Rad9, and participate in the activation of this route. Previous results obtained in the laboratory where this work was developed suggest that yH2A-S129 is involved in DDC, here we want to determine if H3-K79me also controls DDC activation. Since the methylation of lysine 79 in H3 histone is catalyzed by Dot 1 protein, the absence of meH-K79 is secured in Dot 1 motile cells. The active/ inactive status of the late replication origins is regulated by the replication damage checkpoint (DCR, of English DNA replication checkpoint), but in Tofl absence, it allows the intervention of Rad9. When there is no problem in the progress of replication, the origins are sequentially activated according to their programming (early - early / late - late). However, if replication starts, problems arise, the checkpoint is activated, the progression of replication forks from active origins is blocked, and it is repressed the activation of late replication origins that have not yet been activated. To confirm the regulatory function of Dot 1 the activation state of late origins was determined in a Adotl Atofl mutant. The activation/inactivation status of the replication origins was determined using the 2 copy number technique, which is a Q-PCR (quantitative polymerase chain reaction), aimed at detecting the origins of replication. The 2 copy number technique can discern between 2 relative units of fluorescence (active origin) and 1 relative unit of fluorescence (inactive origin). The technique was applied to study 5 OR: 1 early, 4 late and also a negative control zone. The results show that Adotl A tofl cells are unable to repress late replication origins, confirming the regulatory function of Dotl in DDC, presumably by activating Rad9.
URI : http://www.dspace.uce.edu.ec/handle/25000/13092
ISSN : BIBLIOTECA GENERAL - CIENCIAS QUÍMICAS /T/BC004-2016
Aparece en las colecciones: Titulación - Bioquímica Clínica

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